Influenza delle proprietà di diversi grafene

Rapporti scientifici volume 12, numero articolo: 13408 (2022) Citare questo articolo

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I compositi di polimeri e nanomateriali a base di grafene (GBN) combinano una facile lavorazione su geometrie di membrana 3D porose grazie agli stimoli di differenziazione polimerica e cellulare dovuti ai riempitivi GBN. Con l'obiettivo di fare un passo avanti verso l'applicazione clinica dei compositi polimero/GBN, questo studio esegue un'analisi comparativa sistematica e dettagliata dell'influenza delle proprietà di quattro diversi GBN: (i) ossido di grafene ottenuto da processi chimici della grafite (GO); (ii) ossido di grafene ridotto (rGO); (iii) grafene multistrato prodotto mediante metodo di esfoliazione meccanica (Gmec); e (iv) grafene a bassa ossidazione tramite esfoliazione anodica (Ganodic); disperso in membrane porose di policaprolattone (PCL) per indurre la differenziazione astrocitica. Le membrane piatte PCL/GBN sono state fabbricate mediante tecnica di inversione di fase e ampiamente caratterizzate in morfologia e topografia, struttura chimica, idrofilicità, adsorbimento proteico e proprietà elettriche. Sono stati eseguiti test cellulari con cellule di glioma C6 di ratto, come modello per astrociti cellula-specifici. Sorprendentemente, il basso carico di GBN (0,67% in peso) ha causato un'importante differenza nella risposta della differenziazione C6 tra le membrane PCL/GBN. Le membrane PCL/rGO e PCL/GO presentavano i marcatori biomolecolari più elevati per la differenziazione degli astrociti. I nostri risultati hanno indicato i difetti strutturali chimici nei nanomateriali rGO e GO e i meccanismi di adsorbimento delle proteine come la causa più plausibile che conferisce proprietà distintive alle membrane PCL/GBN per la promozione della differenziazione astrocitica. Nel complesso, il nostro studio comparativo sistematico fornisce conclusioni generalizzabili e nuove prove per discernere il ruolo delle caratteristiche dei GBN per la ricerca futura sulle membrane composite a fibra cava 3D PCL/grafene per modelli neurali in vitro.

La barriera emato-encefalica (BBB) è una struttura dinamica e complessa di capillari cerebrali che controllano selettivamente l'omeostasi del sistema nervoso centrale (SNC) e lo proteggono da tossine o agenti patogeni1,2. Sfortunatamente, molte strategie terapeutiche promettenti non hanno mostrato i risultati attesi poiché la BBB rappresenta un ostacolo critico per il trattamento delle malattie del sistema nervoso centrale. Pertanto, impedisce alla maggior parte dei farmaci terapeutici di entrare nel cervello a causa delle loro proprietà di barriera fisiche, biochimiche e specifiche3,4.

Lo sviluppo di modelli neurali in vitro costituisce una fonte di conoscenza potenzialmente essenziale per la comprensione delle malattie neurodegenerative e la progettazione di nuove terapie neuroprotettive. Possono fornire un’opportunità per pianificare nuove piattaforme di screening farmacologico, basate su colture di cellule neurali, per sperimentazioni cellulari mirate ai disturbi neurologici. La realizzazione di modelli BBB in vitro è della massima importanza poiché aiutano a valutare in modo affidabile l'efficacia di nuovi farmaci e terapie per i disturbi cerebrali. Lo sviluppo di modelli BBB dinamici (DIV-BBB), che utilizzano fibre cave polimeriche commerciali come piattaforme per la coltura di cellule endoteliali nella loro superficie luminale e ricreano l'ambiente fisiologico in termini di fluidodinamica, ha dimostrato una ricostruzione in vitro molto più efficiente della BBB (misurata indirettamente attraverso la resistenza elettrica transendoteliale (TEER)) rispetto al metodo Transwell di riferimento1,5. Tuttavia, i modelli DIV-BBB presentano ancora valori TEER molto più bassi rispetto ai tessuti BBB nativi.

La co-coltura di cellule endoteliali con astrociti è stata proposta come una procedura efficace per migliorare la ricostruzione della BBB in vitro, poiché è stato osservato il ruolo chiave che gli astrociti svolgono nello sviluppo e nella funzione del cervello, e nella regolazione del fenotipo delle cellule endoteliali. cellule nei modelli BBB attraverso la regolazione della comunicazione cellula-cellula tramite fattori solubili e interazioni dirette astrociti-cellule endoteliali6. I lavori sui modelli DIV-BBB di solito impiegano co-colture di cellule endoteliali e di glioma di ratto C6 indotte sugli astrociti7,8,9. I protocolli biochimici per la differenziazione di C6 sono in qualche modo ben standardizzati e quindi questi lavori presuppongono una differenziazione astrocitica soddisfacente. Tuttavia, le fibre cave polimeriche commerciali utilizzate per questa applicazione (principalmente polipropilene e polivinilidene difluoruro) presentano scarsa adesione cellulare e sono bioinerti. Inoltre, nel nostro lavoro precedente10, abbiamo osservato che, nonostante l'utilizzo di protocolli standard per indurre la differenziazione degli astrociti delle cellule C6 sulla superficie delle fibre cave polimeriche di policaprolattone (PCL), la velocità e la qualità della differenziazione erano limitate in contrasto con il controllo positivo dei vetrini coprioggetto.

rGO (10.8%) > Gmec (3.6%) > Ganodic (3.0%). We note that, although in principle, the oxygen content could be also evaluated from the data gathered in Table 1 by making some assumptions on the bond type (e. g., epoxy or hydroxyl), the intrinsic asymmetry of the graphitic carbon band would usually lead to an overestimation of the oxygen atomic percent. Indeed, even when the graphitic bands are fitted with an asymmetric function, as in the present work (see “Graphene-based nanomaterials synthesis and characterization” for details), part of the intensity actually coming from the tail of the graphitic signal is wrongly assigned to oxygen-containing groups. However, although the oxygen content is more accurately determined from the survey spectra (Table S1), the deconvolution data are still useful for a semi-quantitative comparison between the different materials (Table 1)./p> PCL/Ganodic > PCL/rGO > PCL/Gmec. Particularly, on PCL/Gmec membranes (Fig. 3A) there were areas where Gmec was not detected. In contrast, the rest of PCL/GBN membranes presented GBNs concentration at any point measured on the surface. It is also remarkable the low absolute intensity of the Raman spectrum of PCL/Ganodic membranes (Fig. 3B) and the presence of high intensity bands corresponding to GO throughout PCL/GO surface (Fig. 3D). Raman and FTIR spectroscopy in Fig. S2A,B, respectively, confirm the presence of characteristic bands of GBNs in the PCL membranes./p> PCL/rGO (22.3 ± 2.7%) > PCL/Ganodic (9.1 ± 0.7%) > PCL/Gmec (8.8 ± 2.7%) > PCL (4.7 ± 2.7%). Specifically, PCL, PCL/Gmec and PCL/Ganodic membranes yielded round-cell morphology (Fig. 5A–C) and 60–75% of the total cells displayed only one cellular projection (Fig. 5G). Remarkably, C6 cells cultured on PCL/Gmec (Fig. 5B) formed cell clusters that resembled multicellular spheroid-like structures as previously reported63. In contrast, PCL/rGO and PCL/GO membranes substantially stimulated the formation of two to five cell extensions, resembling the typical stellate morphology of astrocytes (Fig. 5D,E,G). Both PCL/rGO and PCL/GO membranes promoted a marked change in cell shape to an asymmetrical shape with elongated processes. Around 22% and 31% of C6 cells exhibited more than two projections on PCL/rGO and PCL/GO membranes, respectively, a proportion significantly higher than that estimated in C6 cells grown on glass coverslips (positive controls), where only 3% of cells had more than two cellular projections./p> PCL/GO (2.37 ± 0.15) > PCL/rGO (2.33 ± 0.16) > PCL/Gmec (1.34 ± 0.13). Interestingly, the expression levels in PCL/Ganodic, PCL/GO and PCL/rGO membranes were significantly higher in comparison with the level in PCL membranes normalized to 1 (Fig. 5H). Regarding Slc1a3 (Glast) expression, only C6 cells grown on PCL/rGO (1.66 ± 0.31) and PCL/GO (2.97 ± 0.06) membranes showed significantly increased levels when compared with C6 cells cultured on PCL membranes (Fig. 5H). Finally, Fig. 5I presents the Western blotting of cell lysates, revealing a relative 1.6-times increase in nestin protein expression in C6 cells cultured on PCL/rGO and PCL/GO membranes compared to PCL./p> 99.8%, Honeywell) solutions and UV light, and washed with sterile PBS to remove EtOH traces, all in a laminar flow cabinet./p>